1. 從37℃培養(yǎng)16~20 h 的新鮮平板中挑取一個單菌落（如大腸桿菌DH52），或1 ml 新鮮的16~20 h過夜培養(yǎng)物，轉(zhuǎn)到一個含有100ml LB培養(yǎng)基的1 L 或500 ml 培養(yǎng)瓶中。于37℃振搖培養(yǎng)約2~3 h（旋轉(zhuǎn)搖床200~300 r/min），每隔20~30 min測量OD600值≈0.4。
2. 在無菌條件下將細菌轉(zhuǎn)移到一個，用冰預(yù)冷的50 ml 聚丙烯離心管中，冰上放置10~20 min。
3. 于4℃4000轉(zhuǎn) /分離心10 min，回收細菌細胞。
4. 將管倒置1 min，以使后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡。
5. 以10 ml 用冰預(yù)冷的0.1 mM CaCl2重懸每份沉淀，放于冰上 ， 4℃4000轉(zhuǎn) /分離心10 min，回收細菌細胞。
6. 每50 ml 初始培養(yǎng)物用2 ml 冰預(yù)冷的0.1 M CaCl2重懸每份沉定，此時，可以迅速將細胞分裝成小份，液氮中冰凍，-70℃貯存?zhèn)溆谩?/p>
7. 用無菌吸頭從感受態(tài)細胞懸液中取200 μl 轉(zhuǎn)移到無菌的微量離心管中，加DNA或連接反應(yīng)混合物（體積≤10 μl，DNA≤50 ng），輕旋以混勻內(nèi)容物，冰浴30 min。
8. 將離心管放到預(yù)加溫到42℃的水浴中，90 s。
9. 將混合物快速轉(zhuǎn)移到冰浴中，冷卻1~2分鐘，加入適當?shù)呐囵B(yǎng)基在37 ℃培養(yǎng)45 分鐘，使細胞復(fù)蘇，并表達質(zhì)粒所攜帶的轉(zhuǎn)化基因。
10. 將適當體積（每個90 mm平板可達200 μl）已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)移到相應(yīng)抗生素的平板培養(yǎng)基上。
11. 將平板置于室溫至液體被吸收 ，倒置平板于37℃培養(yǎng)箱中，12~16 h，平板培養(yǎng)，克隆在此期間應(yīng)該出現(xiàn)，否則轉(zhuǎn)化不成功。
