病毒核酸檢測(nucleic acid test，NAT)現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于血液及其制品的病毒篩查、臨床抗病毒/藥物治療療效監(jiān)測等。但核酸檢測容易受到檢測樣本的基質(zhì)效應(yīng)和檢測病毒的基因變異等多種因素的影響，使得不同的實驗室應(yīng)用不同的方法學(xué)進行核酸檢測的結(jié)果，在量值、靈敏度和特異性方面常出現(xiàn)較大的差異。為使不同實驗室，不同方法間檢測的結(jié)果具有可比性，就必須使檢測標準化， 而標準物質(zhì)是檢測標準化的核心。

標準物質(zhì)的種類

由于血清中病毒核酸的量值不能單獨應(yīng)用物理和(或)化學(xué)的方法進行準確測定，必須通過一定的核酸擴增或雜交過程并經(jīng)相應(yīng)的數(shù)據(jù)處理后才能推測出血清中病毒核酸的原始數(shù)值。所以傳統(tǒng)意義的一級參考測量程序(物理和化學(xué)方法)和一級標準物質(zhì)在核酸檢測中還不存在。病毒核酸檢測標準物質(zhì)目前通常分為國際標準物質(zhì)、國家或地區(qū)標準物質(zhì)和實驗室內(nèi)部的工作制劑等三個等級。

1.核酸檢測用國際標準物質(zhì)(reference material)

是指由WHO 多中心研究后由專門委員會認可的，經(jīng)過穩(wěn)定性和組成完整性檢驗的，在國際范圍內(nèi)用作有關(guān)量的其他標準定值基礎(chǔ)的物質(zhì)，目前均由英國國家生物學(xué)標準物質(zhì)和質(zhì)控物研究所(National Institute for Biological Standards and Control，NIBSC)研制并提供。NIBSC于1997年建立了第一代HCVRNA 核酸檢測用國際標準，分別于1999年、2000年、2002年和2003年建立了第一代HIVG1 RNA、HBV DNA、Human parvovirus B19和HAV RNA 核酸檢測用國際標準(表9G1)。核酸檢測用國際標準物質(zhì)沒有高純度要求，其產(chǎn)量也沒必要滿足常規(guī)實驗室要求，通常制備一批次可供5～10年應(yīng)用。

2.國家或地區(qū)標準物質(zhì)

主要面向一個國家或地區(qū)。在有國際標準物質(zhì)的情況下，可溯源至國際標準，如衛(wèi)生部臨床檢驗中心研制的HBV DNA 和HCV RNA 國家標準物質(zhì)。在沒有國際標準的情況下，國家標準物質(zhì)管理組織可以建立國家標準物質(zhì)并自行規(guī)定單位，諸如意大利HCV RNA 國家標準物質(zhì)。

3.實驗室內(nèi)部用的核酸檢測工作制劑

是指相關(guān)診斷試劑生產(chǎn)廠家，在實際工作中用于校準或檢查實物量具、測量儀器或標準物質(zhì)的工作標準。如Roche、Chiron 和Bayer等公司自己用的核酸檢測工作標準國家或地區(qū)標準物質(zhì)和實驗室內(nèi)部的工作制劑等的量值應(yīng)溯源至國際標準物質(zhì)。其測定值的不確定度也應(yīng)大于并包含上一級標準物質(zhì)的不確定度。

標準物質(zhì)的制備

目前，病毒核酸檢測用國際標準物質(zhì)的制備已經(jīng)程序化，HCV RNA、HIVG1 RNA、HBV DNA、Humanparavo virus B19和HAV RNA的第一代國際標準物質(zhì)，都是按照WHO 的固定程序制備的。

其過程包括原材料的選擇和分裝、穩(wěn)定性和均勻性檢驗、多中心合作研究定值、WHO認可三個階段。

下文就原材料的選擇和分裝進行介紹。

一、原材料的選擇原則

在選擇用于制備病毒核酸標準物質(zhì)的原材料時，通常應(yīng)該遵循如下基本原則。

1.基質(zhì)相同或相近的原則

核酸檢測用標準物質(zhì)所選的原始材料，基質(zhì)應(yīng)和使用的要求相一致或盡可能接近，這樣可以消除方法基質(zhì)效應(yīng)引入的系統(tǒng)誤差。如臨床日常檢測的標本使用的是血清(漿)，則相應(yīng)標準物質(zhì)的基質(zhì)也應(yīng)是血清(漿)；如臨床標本的基質(zhì)為細胞，則標準物質(zhì)的基質(zhì)亦應(yīng)為細胞。目前WHO認可的核酸用國際標準物質(zhì)所選的原始材料，是應(yīng)用混合的陰性血漿[HBGsAg(-)、抗HCV(-)、HCV RNA(-)、HIV 抗原檢測(-)、HIVG1 RNA(-)、HAV RNA(-)和Parvovirus B19(-)]稀釋陽性血漿得到，陽性血漿中含有相應(yīng)經(jīng)過滅活處理的野生型病毒。

2. 原始材料的均勻性原則

由于原始材料可能為多個來源，因此必須嚴格混勻以保證材料的均勻性。原始材料可以分成相同的幾份或不同的幾份，一次制備兩批次或多批次的候選國際標準物質(zhì)，如NIBSC在制備第一代HCV 核酸檢測用國際標準時，除制備了兩批次凍干粉候選標準物質(zhì)外，還制備了一批次的液體候選標準物質(zhì)，這樣可以監(jiān)測制備過程對標準物質(zhì)的影響是否相同和選擇國際標準的最佳保存形態(tài)。

3.有代表性及靶病原體含量高的原則

篩選的自然存在的病毒應(yīng)具有代表性，并且目的分析物含量要高。要注意病毒的不同的基因型的分布、病毒核酸常用于核酸擴增檢測區(qū)域的保守性，避免使用含有已發(fā)生變異的特殊病毒的原材料。

4.容易大量獲得

易大量獲得，可有效地保證標準物質(zhì)的制備原材料有足夠的來源，一次也可大量制備，也可有效地保證成品的均一性。

5.無純度要求

用于病毒核酸制備的原材料可以是純的病原體或培養(yǎng)物，也可以是混雜在臨床標本的混合物，只要其基質(zhì)中不含影響檢測的物質(zhì)即可。

6.生物安全性

用于病毒標準物質(zhì)制備的原材料一般均來自于感染者的標本，均具有生物傳染危險性，因此，在不影響靶核酸的穩(wěn)定性的情況下，應(yīng)盡可能在制備前進行滅活處理。理想情況下，是采用無生物傳染危險性的原材料如體外克隆表達的病毒樣顆粒來制備。

7.防污染

處理原始材料時，要注意防止物理、化學(xué)和微生物方面的污染。

8.人工合成的病毒核酸的篩選

選擇人工合成的病毒核酸作為相應(yīng)標準物質(zhì)制備的原材料時，合成核酸片段序列選擇、長度和理化特性應(yīng)適用于臨床使用的商品試劑盒，特別要注意的是適用于不同的核酸純化方法。其生物安全性、易獲得性、使用的方便程度均應(yīng)明顯好于天然候選物。但裸露的RNA 容易受核糖核酸酶的降解而穩(wěn)定性差。

二、原材料的分裝

標準物質(zhì)在液體分裝時，會造成分裝體積的不均勻。因此在分裝過程中，每隔一定數(shù)量都會抽取一分裝單位進行稱量，并通過稱量結(jié)果計算分裝的變異系數(shù)。如NIBSC在制備病毒核酸檢測用HAV RNA、HCV RNA、HIV RNA、HBV DNA和B19 DNA國際標準時，采用稱重的方法確定分裝的不確定度分別為0.29% 或0.39%、3.2%、0.4%和0.6%、0.63%和0.71%。并在分裝時盡量避免生物的，化學(xué)的或灰塵污染，操作可以在清潔級的房間內(nèi)操作或在配備高效微?？諝膺^濾器的層流柜中操作。分裝應(yīng)盡快在短時間內(nèi)完成，以確保同一批次所有的分裝單元是在同一時間同樣條件下分裝。

此外，分裝用分配器、檢測用儀器均應(yīng)進行校準。所有用于制備的玻璃器皿或一次性消耗品均應(yīng)經(jīng)過高壓滅菌消毒。用于制備RNA的玻璃器皿應(yīng)經(jīng)過去核糖核酸酶的處理，一次性消耗品應(yīng)為無脫氧核糖核酸酶和核糖核酸酶的制品。

本文內(nèi)容摘自李金明教授主編《實時熒光PCR 技術(shù)》(第2版)第9章 病毒核酸檢測的標準物質(zhì)及其應(yīng)用。